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    免疫熒光實(shí)驗(yàn)為你講述染色的方法

    發(fā)布時(shí)間: 2022-07-24  點(diǎn)擊次數(shù): 1390次
     
      免疫熒光實(shí)驗(yàn)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。
      免疫熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
      免疫熒光實(shí)驗(yàn)的染色方法:
      1、取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿,用0.01MPBS洗2-3遍。
      2、加入0.3%的Tritonx-100,37℃,30rain
      3、加入4%多聚甲醛試問(wèn)固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
      4、正常阻斷血清1:20封閉試問(wèn)20-30min,抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清。
      5、去掉正常血清,直接加入一抗,37℃孵育1h或4℃過(guò)夜??贵w以0.01mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。
      6、0.3%TritonX-100洗5min,0.01mol/IPBS洗5min,0.3%TritonX5min,0.01MPBS洗5rain。
      7、加入FITC-二抗或TRITC-二抗,37℃,孵育1h。
      8、0.3%TritonX-100洗5rain,0.01mol/LPBS洗5min,0.3%TritonX5min,0.01mol/LPBS洗5min,用濾紙吸干。
      9、90%甘油(PBS配制)封片。
      10、激光掃描共焦顯微鏡下觀察,或于4℃避光保存。
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